上一期我们选了一篇农业领域的客户文献来给大家实例讲解了一下，回顾请戳：【修饰专栏】MCP-磷酸化修饰与非靶代谢在大豆盐胁迫中的应用
本期，我们从农业领域转向医学领域。我们选择了一篇非常典型的文献，来具体解析如何利用磷酸化修饰组定量分析，来研究疾病的机制，以及找到新的治疗靶点。
肉瘤（sarcomas）是一种罕见的多样性恶性肿瘤，多发于骨头和结缔组织。尽管针对肉瘤有手术、放疗、化疗等多种治疗方法，但晚期肉瘤患者存活率低的情况长期没有得到改善。亟需新的、靶向的系统治疗方案。
June 20, 2017; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-16-2550
恶性肉瘤磷酸化蛋白组表达谱揭示ALK和MET或可作为滑膜肉瘤亚型的新型治疗靶点
Phosphoproteomic Profiling Reveals ALK and MET as Novel Actionable Targets across Synovial Sarcoma Subtypes
Cancer Res：IF=9
▶ 研究材料：20种恶性肉瘤细胞株
▶ 技术方法：磷酸化修饰定量蛋白质组
技术路线
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研究结果
1. 样本选择：
经过严格筛选，作者选定了20株肉瘤细胞株，并展示相关信息：
2. 磷酸化修饰组分析：
对上述细胞株，进行磷酸化修饰组分析。磷酸化修饰组最终一共鉴定到来源于654个蛋白的1090个酪氨酸磷酸化肽段/位点。
进一步利用这些磷酸化修饰肽段的表达量进行层次聚类分析，从下图可以看到：这些磷酸化肽段表达可明显区分为两种模式——成年人和小儿，而小儿肉瘤细胞株又区分为两个子集（可以看到磷酸化修饰的模式与疾病分类非常一致）。后续可利用生物信息学进一步挖掘其中的重要信息：
同时，将磷酸化修饰组结果中，最为关注的激酶数据专门挑出来，进行进一步整理和统计，可以看到不同的激酶种类、数量和样本中的表达情况：
3. 挑选出关键蛋白，进行表达验证和初步研究
有了这么丰富的组学数据，就可以对不同细胞系的修饰组定量结果进行比较，将其中具有显著修饰表达差异的蛋白跳出来，后续即可围绕其进行深入研究，作者从中组学结果中挑选的是蛋白激酶——ALK。
首先进行初步的验证和研究：
（1）验证ALK的修饰量是否的确发生改变：WB实验
（2）初步阐述ALK发生修饰变化的机制：下图可见ALK基因发生了截短和重新拼接，从而使得其功能异常
4. 对挑选出的关键蛋白，进行进一步功能验证
（1）体外水平验证功能：确认ALK抑制能够抑制肿瘤细胞生长+WB检测ALK相关信号通路表达情况：
（2）在体水平验证功能：ALK/MET抑制剂药物，能够抑制肿瘤载荷动物的肿瘤生长
5. 对挑选出的关键蛋白，进行临床相关研究
对43例来自于病人的肿瘤组织，进行分析：免疫组化分析发现14%的肿瘤组织具有ALK高表达+FISH分析确认ALK具有截短形式。
6. 扩展研究
磷酸化蛋白质组在揭示ALK异常的同时，也发现了很多其他蛋白的异常修饰变化，由此提示肉瘤可能存在多通路协同作用的机制。因此，作者采用相同的路线，进行了扩展研究：（1）研究了修饰组结果中的另外一个分子PDGFRα的异常修饰变化，以及进行了相关功能的确证，证实PDGFRα也是一个有效的治疗靶点；（2）发现本文研究的两个靶点——AKL/MET与PDGFRα的联合干预，能够取得更好的治疗效果。
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老司机心得（必看）
该研究是利用蛋白质翻译后修饰，揭示新的疾病机制，寻找治疗靶点的代表性文章，主要思路： “样本选择 → 磷酸化修饰组定量分析 → 筛选感兴趣的蛋白，并验证表达变化 → 功能验证（细胞＆动物） → 临床相关分析（表达水平与临床指标相关性分析），以及进一步进行了药物联用的探索。通过磷酸化修饰组的高通量分析筛选修饰水平发生变化的蛋白和位点，进而顺藤摸瓜找到关键调控机制，并确认干预治疗的效果。在医学基础研究中非常值得借鉴和参考！
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老司机带你走的更远
（1） 该文章的设计，可以说是很完整了，发表的杂志也算是专业领域内的当红辣子鸡。以该设计套路为参照，可以进一步设计成简配版和高配版。简单来说，简配版对应短平快地灌水低分杂志，高配版则用于冲大文章。具体怎么简配、怎么高配，后续我们会有一期专门总结套路，其中会跟大家详细解析，敬请期待。感兴趣的老师，可以先了解下下述的典型文献：
▶简配版：Quantitative cardiac phosphoproteomics profiling during ischemia-reperfusion in an immature swine model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017 Jul 1;313(1):H125-H137.（IF=3.3）
▶高配版：Quantitative phosphoproteomics reveal mTORC1 activates de novo pyrimidine synthesis. Science. 2013 Mar 15;339(6125):1320-3. （IF=37.2）
（2） 上述的分析模式，不仅适用于磷酸化修饰研究，也适用于从其他翻译后修饰（如乙酰化、泛素化、甲基化，等等）的角度来研究生理过程、疾病或药物机制。基本的设计套路和模式是相似的，后续我们也会有其他种类修饰的专门内容中为大家做详细介绍，敬请期待。（广告时间：除了磷酸化，中科新生命还可提泛素化、酰化、甲基化、N糖基化等各种修饰组学分析服务）。同样先给大家推荐一些文献：
▶乙酰化：SIRT3 mediates multi-tissue coupling for metabolic fuel switching. Cell Metab. 2015 Apr 7;21(4):637-46. （IF=18.1）
▶泛素化：Landscape of the PARKIN-dependent ubiquitylome in response to mitochondrial depolarization. Nature. 2013 Apr 18;496(7445):372-6. （IF=40.1）；Lenalidomide Causes Selective Degradation of IKZF1 and IKZF3 in Multiple Myeloma Cells. Science. 2014 Jan 17;343(6168):301-5. （IF=37.2）