题目：A time-resolved multi-omic atlas of the developing mouse stomach
期刊：Nature Communications
影响因子：12.353
主要技术：Label-free
研究背景
哺乳动物的胃结构高度多样化，其器官功能依赖于正常的胚胎发育。尽管已有多项关于胃发育过程中形态学变化的研究，但是大多数胃发育研究都集中在一小组蛋白质或特定途径上，阻碍了对系统生物学中整个过程的理解，缺乏对潜在分子变化的全系统分析。
研究内容及结果
1. 小鼠胃发育的蛋白质组学图谱
为了绘制发育中的小鼠胃的蛋白质组图谱，作者选择了15个时间点收集小鼠胃样品，覆盖胚胎期（E12.5即胚胎第12.5天、E13.5、E14.5、E15.5、E16.5、E17.5和E18.5）、产后天（D1、D3、D5）和产后周（W1、W2、W3、W6、W8），每个时间点3个生物学重复（图1a）。作者使用Label-free定量蛋白质组学共鉴定到12108种蛋白质。一般而言，管家蛋白，例如TUBB4B和HSP90B1，在整个发育阶段表现出稳定的表达，在对数变换后，蛋白质的相对丰度（iFOT）跨越约8个数量级，这反映了胃蛋白质组的高度动态性质（图1e）。作者选取了2890种蛋白质代表胃蛋白质组的核心组分，这些蛋白质的功能在多种途径中显著富集，包括代谢、剪接体、蛋白质加工和其他途径（图2）。
图1 小鼠胃发育蛋白质组学
图2 核心蛋白KEGG分析
2. 小鼠胃发育的三个不同阶段
蛋白质机制的变化决定了器官发生和发育。虽然整个发展过程是逐渐发生变化的，但在某个关键阶段会发生显著变化。为了在蛋白质表达水平上研究这些变化，作者进行了无监督层次聚类分析（HC）和主成分分析（PCA），发现两种分析方法都将实验划分为三个明显不同的阶段：Ph1 （E12.5-E16.5），Ph2 （E17.5-W2）和 Ph3 （W3–W8）（图3a）。为了鉴定每个阶段的代表性蛋白质并了解它们的生物学意义，作者对三个阶段的4300个差异表达蛋白进行了蛋白质共表达分析和KEGG分析（图3b，c）。KEGG分析表明Ph1与细胞分裂有关。Ph1具有最多的差异表达蛋白，主要参与剪接体、RNA转运、DNA复制、细胞周期和嘧啶代谢等通路途经（图2c）。Ph2涵盖围产期和哺乳期，是胃在形状和质量上增长最快的阶段，Ph2具有最少数量的高表达蛋白质，富含ECM-受体相互作用、溶酶体和粘着斑（图2c）。Ph3是成熟期，胃已经获得代谢功能，当婴儿小鼠断奶（出生后20-22天）并开始吃食物36时，Ph2和Ph3之间的边界位于W3。
图3 小鼠胃三个发展阶段及其生物功能
3. 胃发育过程中关键胃蛋白的动态变化
作为主要的消化器官，胃产生许多消化酶，因此，作者追踪了胃发育过程中三个重要的胃蛋白酶原（CYM、PGA5和PGC）的表达动态变化（图3d）。CYM和PGA5在Ph2中高度表达，PGC仅在Ph3中检测到。Ph2中的小鼠以牛奶为食，高水平的CYM和PGA5表明它们可能在乳蛋白消化中起重要作用。W3期检测到PGC，并且其在W3后维持在高水平，这一发现与已报道的PGC在成人胃中表达结果一致。胃蛋白酶原在胃质子泵产生的酸性环境中被激活，胃质子泵是存在于胃泌酸粘膜壁细胞中的H+/K+-ATP酶，它有两个亚基（ATP4A和ATP4B），是介导酸分泌的离子传输系统的关键部件之一。ATP4A和ATP4B的表达水平在Ph2中同时增加并在Ph3中达到峰值（图3d），标志着随着小鼠胃成熟，壁细胞在Ph2和Ph3中的形成和成熟。
在胃中高度表达的其他蛋白质（ANXA10、CLDN18、CTSE、GHRL、GIF、TFF1和VSIG1）维持正常的胃功能（图4）。其中，GIF是由胃主细胞产生的糖蛋白；ANXA10是在胃粘膜中表达的钙和磷脂结合蛋白；VSIG1是腺体胃上皮细胞正常分化所需的细胞粘附蛋白；CLDN18是胃上皮相关的密蛋白。在发育的Ph3中这些蛋白质的逐渐增加表明它们可能是成熟胃的标志物。
图4 七种胃蛋白在小鼠胃发育中表达变化
4. 差异表达剪接异构体
基于MS的蛋白质组学分析的同时，作者还在相同时间点的小鼠胃组织上进行高通量RNA-Seq分析，两个数据集同时鉴定到10994个基因。转录组数据的无监督层次聚类分析（HC）和主成分分析（PCA）将整个小鼠胃发育过程分成两个阶段（图5a）。该分类几乎完全与从蛋白质组数据获得的3个阶段重叠，仅有与基于转录组的分类的一个时间点（E17.5）差异。这些观察结果表明，基于蛋白质或RNA表达水平，从E12.5到W8的发育过程可大致分为三个阶段。半监督层次聚类分析基于其时间表达模式将基因分为四组（图5b），第一阶段差异表达的大多数基因富含几种途径，例如剪接体、RNA转运和细胞周期（图5c）；第二阶段包含两个参与粘着斑、ECM-受体相互作用，几种信号传导途径和脂肪酸或氨基酸降解的基因组；第三阶段主要与氧化磷酸化和代谢活动有关。总体而言，基于RNA-Seq的聚类分析揭示了三个阶段，与蛋白质组数据获得的生物学特征有相似性。
前人研究揭示了剪接异构体在各种生物过程中的作用，如器官发育，当通过FPKM≥1过滤时，作者发现7769个基因的24346种剪切异构体，其中2989种异构体在三个阶段（基于RNA-Seq的聚类）差异表达，在这些通路调节因子或转录因子中，并非所有剪接异构体都发生显著变化，其中一些变异体在mRNA水平上没有或非常低表达（图5d）。这些结果表明，只有一小部分剪接异构体在蛋白质水平上表达，并且在功能上与胃发育有关。
图5 小鼠胃发育转录组学
5. 胃发育与胃癌的相关性
作者收集84名弥漫型胃癌患者白质组数据集，在蛋白质组水平上研究胃发育和胃癌的相关性。作者用蛋白质组学和转录组学方法分别鉴定到241和725个转录调节因子，发现在与器官发育和癌症相关的充分表征的转录调节因子中。当细胞处于快速分裂和增殖时，它们中的大多数在早期胚胎阶段（Ph1）中更高表达，例如CDX2是胃癌的预后标志物，其RNA在胃发育的早期阶段升高。
在胃发育的八个关键信号通路中的蛋白质或基因中，有大量蛋白质或基因在胃发育三个阶段中差异表达（图6）。大部分这些基因在弥漫型胃癌（DGC）也是差异表达或突变基因。如Wnt信号通路中的WNT5A显著上调，而Apc和Ctnnb1在DGC中突变。胃发育和DGC中这些调节因子的改变清楚地表明，转录调节因子和胃癌中的信号传导途径的失调。
为了进一步将胃发育与胃癌的信号通路水平相关联，作者进行双尾超几何统计检验以确定在胃发育和DGC之间的特定途径上是否存在改变的基因产物显著重叠。发现除hedgehog信号通路外的所有途径均表现出高度相关性（-log10P-value >3）（图7a），表明胃发育和胃癌的发生可能是两个相关的过程。为了获得DGC中鉴定的上调蛋白在胃发育中表达的全局视图，作者将939种肿瘤差异表达的蛋白质映射到小鼠胃发育期间的15个时间点中，发现 Ph1 鉴定出蛋白质的百分比明显高于后期时间点（图6b）。这说明胃癌与胚胎胃发育具有许多共同特征，并且该疾病可能由转录因子和细胞信号传导的失调引起。
图 6 涉及胃发育和胃癌的关键信号通路
图7 胃发育与胃癌相关性分析
文章小结
作者描绘了小鼠胃发育过程蛋白质和 mRNA 水平全景图，确定了胃发育过程中三个不同阶段。将蛋白质组学和转录组学数据结合在一起，检测和验证可能对胃发育有根本影响的可变剪接转录本。通过比较胃发育的蛋白质组学特征与弥漫型胃癌的蛋白质组学特征，发现显著数量的途径调节因子，特别是在DGC中上调或经常突变的转录因子，在胃发育期间也差异表达，证明了胃癌和胃发育之间存在相关性。
解析文献
Xianju Li, Chunchao Zhang, et al. A time-resolved multi-omic atlas of the developing mouse stomach[J]. Nature Communications, 2018, 9:4910.