淋巴结是一种次级淋巴器官，可以通过细胞间的紧密相互作用来诱导适应性免疫反应。淋巴结中的生发中心的结构，是B细胞和滤泡辅助CD4+ T细胞聚集并促进抗体成熟的地方。而未分化的T细胞则通过CCR7介导的趋化作用进入淋巴结的髓质区，之后被抗原呈递细胞激活。激活后的T细胞可以通过S1P介导的出流机制重新进入淋巴循环，这被CD69抑制在激活的和LN驻留的细胞上。生发中心CD8+ T细胞（fCD8）与对多种病毒感染和癌症的免疫控制有关。尽管fCD8与免疫控制有关，但这些细胞的效应机制还没有完全明确。
2023年5月19日，美国哈佛医学院麻省总医院Ragon研究所主任Bruce D. Walker教授团队在Science Immunology上发表题为“Cytolytic CD8+ T cells infiltrate germinal centers to limit ongoing
HIV replication in spontaneous controller lymph nodes”的研究论文。
文章探讨了在没有用药的情况下控制HIV感染的人群中，淋巴结内病毒特异性CD8+ T细胞的功能、克隆组成、空间定位、表型特征和转录谱。结果显示，抗原诱导的增殖和细胞毒性潜能一致地区分了自发控制者和非控制者。T细胞受体分析揭示了外周血和淋巴结内HIV特异性CD8+ T细胞之间的完全克隆重叠。淋巴结CD8+ T细胞的转录分析显示了炎症趋化因子和抗原诱导效应功能的基因特征。在HIV控制者中，细胞毒效应分子穿孔素和颗粒酶B在滤泡中靠近HIV RNA热点的病毒特异性CXCR5+ fCD8中升高。这些结果与fCD8通过炎症招募、抗原特异性增殖和细胞毒性来控制淋巴滤泡感染的证据一致。
实验部分
本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS全景组织细胞定量分析系统对淋巴结组织样本进行多色荧光图像采集。
在本文中作者表示，因为样本来源所限，无法获得足够的来自非控制者的 T 细胞用于与控制者的 HIV 特异性
CD8 +直接用于转录组学比较。为了解决这个问题，作者采取了更为直接的策略：即通过单细胞分辨率的细胞功能测定的方法，从组织原位抓取细胞的作用关系，以此验证及推断GC 访问和持续的细胞溶解潜力是 LN 中长期病毒控制的关键决定因素，并将为引发对淋巴细胞感染和癌症的免疫控制提供更多的信息。
在组织原位单细胞分辨率的功能测定部分，研究者使用了Tissue Cytometry技术作为支撑。Tissue Cytometry技术组织原位整体解决方案不但可以提供真实的切片原位成像结果（相对的一些玻片扫描仪会通过AI针对扫描图像进行优化），而且在真实的成像结果之上对细胞密度极高的淋巴结内部单个细胞进行了精准的数据定量分析，结合其中穿孔素颗粒酶、CD8+细胞的分布以及病毒颗粒的表达情况，提出fCD8 通过抗原驱动的增殖和正在进行的病毒复制位点的瞬时细胞毒性来维持对感染的自发控制。
与单独转录组学分析数据相比，采用Tissue
Cytometry技术相结合的文章数据更加准确翔实，验证结论更加可靠。
- TissueFAXS对淋巴结样本图像采集。（细胞核（DAPI）、HIV gagpol RNA（白色）、CD8（红色）、perforin（黄色）和granzyme B（蓝色））
- StrataQuest软件对淋巴结组织样本上的图像进行组织区域识别和计数，确定每个细胞核是否表达HIV RNA和CD8、perforin、granzyme B等蛋白。
- StrataQuest软件根据细胞形态、CD8的分布和IgD阳性的B细胞来确定淋巴结滤泡生发中心的范围。
- 为了评估细胞毒性和非细胞毒性fCD8细胞与最近的HIV gagpol RNA阳性细胞之间的距离，从图像分析报告中提取了HIV gagpol RNA阳性细胞、穿孔素+颗粒酶B+ CD8+细胞和穿孔素- CD8+细胞的x-y坐标。
Fig 1 HIV复制过程中控制型淋巴结中存在细胞毒性的CD8+T细胞
(A)
自发控制型淋巴结的多色免疫荧光(IF)和RNA Scope图像：HIV gagpol RNA(白色)、CD8(红色)、穿孔素(黄色)和颗粒酶B(蓝色)。毛
(B)
淋巴结组织切片中，共表达CD8+细胞的穿孔素/颗粒酶B细胞密度与HIV
gagpolRNA的细胞密度之间的Spearman相关性。
(C)
根据形态学识别，确定滤泡性生发中心(ROI)，根据相邻切片的形态、相对CD8排除(红色)和IGD染色(绿色)以橙色线条划分。
(D)
滤泡性生发中心共表达CD8+细胞的穿孔素/颗粒酶B细胞与表达HIV
gagpolRNA的细胞之间的Spearman相关性。
Fig 2 fCD8在生发中心HIV感染细胞近端的细胞溶解效应分子
（A）通过DAPI定位，在多色免疫荧光和RNA scope图像上识别细胞边界。在生发中心区域内，识别出HIV gagpol
RNA+细胞（绿色）、CD8+穿孔素-细胞（灰色）或CD8+穿孔素+颗粒酶B+细胞（青色）。
（B）在离最近的HIV gagpol RNA+细胞的指定距离范围内，表达穿孔素和颗粒酶B的fCD8细胞数量（以平均细胞直径相当于8.3 μm增量表示），以细胞数（右轴，青色）和每个距离范围内总fCD8细胞的百分比（左轴，红色，Spearman相关性）进行表示。