昼夜节律紊乱被视为癌症预后不良的一个标志，然而睡眠不足（SD）促进肿瘤发生的生理过程仍不明确；已有研究表明脂肪酸氧化（FAO）失调可增强肿瘤恶性特征，特别是作为FAO的限速酶，ACSL 1在癌症中高表达，但其节律性破坏的作用未知；已知β-内啡肽，一种内源性具有类似吗啡作用肽类物质，其昼夜振荡与生物钟稳态相关，具有抑制癌症的潜能，但不同的给药节律是否能减轻肿瘤尚待研究。
2024年5月，大连医科大学肿瘤干细胞研究院刘强教授团队在Cell Metabolism上发表了题为“Oncogenic fatty acid oxidation senses circadian disruption in sleep-deficiency-enhanced tumorigenesis”的研究论文近期，揭示了FAO是一种将睡眠不足与肺肿瘤发生联系起来的昼夜节律传感机制，并为患有睡眠不足相关癌症的患者提供了一种β-内啡肽时间节律治疗策略。
技术路线图
FAO：脂肪酸氧化；SD：睡眠不足/睡眠剥夺；ACSL1：酰基辅酶A合成酶长链家族成员1；PA：棕榈酸；PA-CoA：棕榈酰肉碱辅酶A；CLOCK：昼夜节律稳态核心基因
研究结果
1. 脂肪酸氧化可感知睡眠剥夺导致的节律紊乱
为了探究睡眠剥夺（SD）对小鼠肺部生理节律的影响，对SD处理后不同时间点的小鼠肺组织进行组学检测。转录组测序筛选出3284个在SD后丧失昼夜振荡的基因，GO富集分析显示这些基因在脂质代谢相关的生物过程中富集，尤其是脂肪酸氧化（FAO）。随后的UHPLC-MS代谢组学进一步证实，SD处理使得小鼠肺组织中昼夜振荡的脂质代谢物数量显著减少， 47种脂质物质发生节律紊乱，其中游离脂肪酸占比最大。
以上结果表明，在基因表达和代谢功能层面，FAO均能够感知生理条件下SD诱导的节律紊乱。
图1. FAO可感知SD处理导致的昼夜节律紊乱
2.睡眠剥夺通过脂肪酸氧化增强癌细胞干性
在此基础上，进一步探讨SD诱导的FAO节律紊乱是否在肺癌发展中发挥作用，为此构建了肺癌小鼠模型并实施SD处理，通过CT图像、HE染色和IHC等结果确认了肺癌形成和干细胞标志物的表达。
为明确SD促进肿瘤发生的机制，对小鼠肺癌组织进行转录组测序，结果显示SD显著上调了与FAO相关的基因表达。此外，脂质代谢组检测也表明，SD处理后脂肪酰肉碱增加，游离脂肪酸减少，且脂肪酸氧化的最终产物乙酰辅酶A和腺苷三磷酸在肺癌中增加，并在SD条件下表现出节律紊乱。此外，向SD小鼠给予脂肪酸氧化抑制剂：依托莫司他（ETO），可逆转肺癌进展及干细胞特性的增强。
以上结果表明，FAO感知昼夜节律紊乱是睡眠剥夺增强肺癌干细胞特性的基础。
图2. FAO节律紊乱增强SD诱导的肺癌细胞干性
3. ACSL1及其产物PA-CoA发挥重要作用
接下来寻找SD诱导FAO节律紊乱从而促进肺癌干细胞特性的关键分子。首先从转录组结果里筛选出13个同时响应节律紊乱和肿瘤进展的FAO基因，其中ACSL1在mRNA和蛋白水平均显著上调。在小鼠体内特异性敲除该基因可逆转SD促进的肿瘤进展，下调肿瘤组织中干细胞标志物的表达。
随后从脂质组检测结果里筛选可能作为ACSL1底物和产物的长链FAO代谢产物，发现SD可降低肿瘤组织中的棕榈酸（PA）水平。敲低ACSL1可恢复SD诱导的PA下降，而补充棕榈酰肉碱辅酶A（PA-CoA）——PA进入FAO的活化态，可挽救ACSL1缺失下被抑制的癌症干细胞特性和肿瘤生长。
以上结果表明，SD扰乱ACSL1的节律，过度激活了它将PA转化为PA-CoA的能力，从而促进FAO，最终导致肿瘤生长。
图3. ACSL1合成的PA-CoA有助于SD诱导的肺癌细胞干性
4. ACSL1的上游调控者是CLOCK
在分子机制方面，首先在不同的细胞系中发现有两种核心生物钟基因：CLOCK和BMAL1，与ACSL1的表达量正相关。随后在肿瘤模型中进行验证，发现SD仅破坏CLOCK基因的节律振荡，而对BMAL1无显著影响。此外，通过分析表观组学公共数据库，发现CLOCK和BMAL1在多种细胞中均占据了ACSL1的启动子区域，并且通过CHIP-qPCR和荧光素酶报告基因分析确认了结合位点。作为验证，分别在鼠源和人源两种肿瘤模型中敲除CLOCK基因，均观察到了肿瘤生长和干细胞特性被抑制的现象。
以上结果表明，核心生物钟基因CLOCK可能通过直接结合到ACSL1启动子上的特定区域来调控该基因的表达。
图4. ACSL1可感知SD诱导的FAO节律失常，促进肺癌发生
5. ACSL1诱导CLOCK发生棕榈酰化修饰，维持其稳定性
进一步的研究发现，敲低ACSL1会反过来降低CLOCK的蛋白水平，但不影响其mRNA水平，说明ACSL1可通过某些机制维持CLOCK的蛋白稳定性；同时考虑到ACSL1催化的PA-CoA可以做为蛋白质棕榈酰化的底物，因此研究者探讨了棕榈酰化修饰在ACSL1和CLOCK互作中的作用。
首先利用酰基-生物素交换（ABE）和免疫印记等技术手段，证实了CLOCK蛋白上确实存在棕榈酰化修饰。然后使用siRNA筛选出了23种可能的棕榈酰转移酶，通过敲低和过表达实验确定了其中的ZDHHC5可介导CLOCK的棕榈酰化。此外，还发现SD 处理一方面以ACSL1依赖的方式增强了CLOCK的棕榈酰化修饰，另一方面也破坏了这一修饰的昼夜节律性。随后，通过在线预测网站swisspalm鉴定了CLOCK的棕榈酰化位点：Cys194，该位点在多物种中保守。进一步地，CLOCK蛋白的降解和泛素化实验表明，棕榈酰化通过抑制泛素化依赖的蛋白酶体降解来稳定CLOCK蛋白。
以上结果表明，ACSL1通过ZDHHC5使得CLOCK在Cys194上发生棕榈酰化修饰，而这一修饰可阻止CLOCK因泛素化而降解，从而维持该蛋白的稳定性。
图5. ACSL 1通过ZDHHC 5对CLOCK进行棕榈酰化修饰，以此稳定CLOCK蛋白
6. 节律性的β-内啡肽给药可作为一种治疗方案
基于上述SD对肿瘤发生发展的影响，研究者考虑基于昼夜节律的内分泌治疗方案。对体外培养的肺癌细胞系分别添加14种睡眠相关激素，发现β-内啡肽（Endor）可显著下调CLOCK和ACSL1的mRNA表达水平，因此后续对β-内啡肽展开节律治疗应用的研究。
对于SD条件下的荷瘤小鼠，研究人员设计了3种β-内啡肽给药方案：每日16:00给药（ZT8-Endor）、每日4:00给药（ZT20-Endor）以及持续给药（pump-Endor）。从表型来看，ZT8-Endor方案显著逆转了SD导致的肿瘤生长，而另外两种方案效果不显著。接下来使用ELISA评估了血清β-内啡肽水平，发现SD处理破坏了β-内啡肽的昼夜节律并使其保持在较低水平， 另外三种给药处理虽都能提高β-内啡肽含量，但仅ZT8-Endor能使其昼夜节律也恢复正常。同样地，在ACSL1和CLOCK含量和肿瘤干性标志物等指标上也存在类似的规律。
图6. β-内啡肽可恢复受到SD干扰的CLOCK/ACSL1节律
7. 人群队列验证
最后为评估以上研究的临床转化潜力，进行了人群队列的前瞻性和回顾性研究。肺癌患者的前瞻性队列数据表明，血清β-内啡肽浓度与睡眠质量正相关，且是癌症发展的潜在预测因素；既往肺癌病例的回顾性分析结果表明，血清β-内啡肽与较好的预后和生存率有关，而与CD166和Ki-67（两种肿瘤标志物）的表达水平负相关。
总而言之，这两组队列数据提供了SD、β-内啡肽、CLOCK和ACSL1可能是肺癌独立预后因素的临床证据。
图7. 肺癌患者的睡眠质量和β-内啡肽水平与CLOCK/ACSL1表达及预后不良呈负相关
研究结论
本研究揭示了睡眠不足（SD）与肺癌发生发展之间的潜在机制，发现了SD可导致脂肪酸氧化（FAO）紊乱，进而促进肺癌干细胞的形成和肿瘤生长。在这一过程中，ACSL1基因与CLOCK基因之间的正反馈循环起到了关键作用。在治疗阶段，通过定时给予β-内啡肽，可以有效逆转SD引起的昼夜节律紊乱和FAO紊乱，从而减轻肿瘤的生长。此外，研究证实睡眠质量和血清β-内啡肽水平与肺癌患者的预后不良密切相关。这一发现表明，FAO作为一种昼夜节律感知机制，在连接睡眠不足与肺肿瘤进展方面具有重要意义。
参考文献
Peng F, Lu J, Su K, et al. Oncogenic fatty acid oxidation senses circadian disruption in sleep-deficiency-enhanced tumorigenesis. Cell Metab. 2024.
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